蛋白质分子的三维结构是生命科学研究中极为重要的信息，X射线单晶衍射技术是目前获得结构信息主要的手段，但如何筛选到第一个蛋白晶体是该技术必需的第一步，也是制约结构生物学发展的主要瓶颈问题之一。现在一般通过规模筛选的方法从众多的溶液中筛选出可结晶的条件，但是工作量较大，效率也不高。回顾了近年来在提高结晶筛选效率方向取得的成就，主要表现在2个方面：一是在传统结晶方法和试剂基础土发展起来的一系列新的高效的结晶技术和筛选试剂盒；二是从生物学、物理学和化学等角度提出的一些提高结晶筛选效率的新技术，主要包括通过分子工程改造蛋白、提高蛋白溶液的稳定和均一性、导入籽晶、共结晶、改善结晶界面和变温筛选等技术。最后展望了该领域未来的发展趋势。
蛋白质纯化与结晶的原理
获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质(>10 mg)，其浓度通常在10 mg/ml 以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖(clone)的方式嵌入表现载体(expression vector)内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌(Escherichia coli)，在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。
蛋白质晶体的培养
在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体(图一) 。
理论告诉我们，好的晶体生长要减少过饱和度到一个低的水平；维持高饱和度可能导致过多晶核的形成，从而产生很多小晶体（如图1.1）。同时，晶体需要缓慢地生长以在表面达到一个高的有序度。然而实际中，并没有遵从这个基本规则。简单的改变过饱和度的方式是改变温度或沉淀剂的浓度。
蛋白质沉淀可以通过添加盐、聚乙二醇或有机溶剂。作为沉淀剂，盐有双重作用，即盐析和盐溶。盐离子屏蔽了蛋白质分子表面的电荷，因此从而减弱了分子间的排斥力。此外，部分水被固定从而不可与蛋白质结合，因为盐离子周围形成水化层。常用的盐是硫酸铵，其优点是溶解性好，对大多数蛋白质无损害，即使浓度很高。
聚乙二醇对水有高亲和性，能像盐那样固定水。而且，它以不同的方式影响蛋白质的溶解度。PEG分子不能超过其半径而更接近蛋白质分子表面，蛋白质分子周围有PEG中心不能接近的水化层。如果蛋白质分子聚集，这些水化层部分重叠，从而不可接近的区域变小。结果，可接近区域变大。从而有更多的空间对PEG分子可用，它们的熵增加（以一些蛋白质熵为代价），系统的自由能降低。因此，蛋白质分子聚集的这种情况在使用PEG时是有利的。
蛋白质结晶中普遍的有机溶剂是MPD。有机溶剂具有静电效应，它们能降低介质的的介电常数。静电力变强，从而压缩蛋白质分子周围离子的双电层。这些分子可以彼此更加接近，如果在一个有利的方向，它们便可以聚集。
一些蛋白质在水中溶解度不好，但是如果加入少量盐（比盐析少的多）就可溶解。移除盐后，蛋白质便会析出。这种盐溶效应可以解释为蛋白质分子表面带电基团和溶液中离子相互竞争的结果。在有溶剂离子时，蛋白质分子不会被离子双层包围，而能通过不同蛋白质分子上异种电荷之间的库仑力相互聚集。如果少量离子被加入，蛋白质周围会形成离子双层，它们彼此之间不扩散不排斥。
其他降低蛋白质溶解度的方法有改变溶液pH或温度。
综上所述，通常结晶蛋白质的步骤如下：
- 仔细检测纯度。
- a.慢慢增加沉淀剂的浓度，如PEG、盐或有机溶剂等。
b.改变pH或温度。
实际中，通常可用作结晶实验的蛋白质的量非常少。要确定最好的结晶条件，经常需要进行大量的实验。因此，每次实验应该用最少量的蛋白质。一个合理大小(0.2×0.2×0.2mm =0.008mm3)的蛋白质晶体重约10μg。因此，1mg纯化的蛋白质可以足够做大约100次结晶实验。
膜蛋白在水中不溶解，因此很难结晶。通常的策略是使用洗涤剂将其溶解于水溶液中，然后采用水溶性蛋白的操作程序(Michel,1990; Sowadski, 1994)。Landau和Rosenbusch（1996）引进一种新的方法能够结晶膜蛋白。他们采用脂立方相作为各种化合物结晶的母体，脂立方相是具有立体对称性的液晶，它们能在脂和水的混合物中形成(Lindblom and Rilfors, 1989)。一些类型的脂立方相是存在的。Landau等人（1997）成功地在某一类型脂立方相中生长出了高度有序的细菌视紫红质（bacteriorhodopsin）膜蛋白晶体(see also Gouaux, 1998)。但仍要看是否这种方法在结晶更多膜蛋白中取得成功。
蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法(Vapor Diffusion Method) 的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质(10-50 mg/ml)溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度(~1.0 M) 的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度(~2.0 M)硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的(图二)。
蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处，但在晶体的内部，却有很大的差异。一般而言，蛋白质晶体除了蛋白质分子外，其他的空间则充满约40 %至60 %之间的水溶液，其液态的成分不仅使晶体易碎，也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现，造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性，让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态，极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构，基本上可视为自然状态下的结构。
蛋白质结构解析的方法简介 到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射和NMR。近年来还出现了一种新的方法，叫做Electron Microscopy。其中X射线的方法产生的更早，也更加的成熟，解析的数量也更多，我们知道，第一个解析的蛋白的结构，就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和缺点。
蛋白质结晶原理（Principles of Protein Crystallization）
蛋白质的X射线结构分析首先要获得合适的单晶。蛋白质结晶学尚未发展成熟，尽管很受人亲睐，特别是受航天飞机中微重力实验(Kundrot et al., 2001; McPherson et al., 1995)的激发。蛋白质结晶是一个反复试验的过程，蛋白质逐渐会从溶液中析出，杂质、晶核及其他未知因素对此过程有所影响。通常，蛋白质越纯，生长晶体几率越大。蛋白质结晶学者对蛋白质的纯度要求要严于生化学家的要求，后者往往在酶催化活性足够高时就很满意。另一方面，为了使蛋白质结晶，不仅要加其他成分，所有蛋白质分子的表面性质也必须是相同的，特别是表面的电荷分布，因为它影响晶体内分子的聚集。质谱是蛋白质结晶中的一种有效工具，例如检测重组蛋白的表达、样品纯度、重原子衍生物及蛋白质结构的特性(Cohen, 1996; Potier et al.,2000)。
蛋白质结晶涉及四个重要步骤如下：
- 蛋白质纯度的确定。如果不够非常纯，必须要进一步纯化。
- 蛋白质溶解于合适的溶剂中，从中它能通过一种盐或有机化合物而析出。溶剂通常是水-缓冲剂溶液，有时加有机溶剂，如2-甲基-2，4-戊二醇（MPD）。正常情况下，沉淀剂也被加入，但是浓度不高于使沉淀产生。对于不溶于水-缓冲剂或水-有机溶剂的膜蛋白，还需要加入去污剂。
- 使溶液过饱和。在这一步中，小聚集体形成，它是晶体生长所需的核。对小分子的结晶来说，相比于蛋白质更为人熟知，晶核的自发形成需要提供表面张力能。一旦这个能障被突破了，晶体开始生长。能障在高水平的过饱和度时很容易克服。因此，在高过饱和度时，晶核更易自发形成。晶核的形成可作为一个过饱和度和其他参数的函数通过多种方法来研究，包括光散射、荧光去极化及电子显微镜。
- 一旦晶核形成，晶体生长正式开始。对低分子量的化合物而言，新分子会逐步结合到正在生长的晶体表面。这是由于这些位置的结合能比较大，相对于分子结合到平滑的表面。这些步骤要么由晶系缺陷造成，要么发生在表面随机形成的晶核。
蛋白质结晶方法大总结
1.1结晶方法(Crystallization Techniques)
1.1.1 分批结晶(Batch Crystallization) 这是最老的最简单的结晶方法，其原理是同步地在蛋白质溶液中加入沉淀剂，立即使溶液达到一个高过饱和状态。幸运的话，不需进一步处理即可在过饱和溶液中逐渐长出晶体。一个用于微分批结晶的自动化系统已被Chayen等人设计出（1991，1992），其微分批方法中，他们在1-2μl包含蛋白质和沉淀剂的液滴中生长晶体。液滴被悬浮在油（如石蜡）中，油的作用是作为封层以防止蒸发，它并不干扰普通沉淀剂，但是干扰能溶解油的有机溶剂(Chayen, 1997; see also Chayen, 1998)。
1.1.2 液-液扩散(Liquid–Liquid Diffusion) 这种方法中，蛋白质溶液和含有沉淀剂的溶液是彼此分层在一个有小孔的毛细管中，一个测熔点用的毛细管一般即可（如图1.2）。下层是密度大的溶液，例如浓硫酸铵或PEG溶液。如果有机溶剂如MPD被用作沉淀剂，它会在上层。以1：1混合，沉淀剂的浓度应该是所期最终浓度的二倍。两种溶液（各自约5μl）通过注射器针头导入毛细管，先导入下层的。通过一个简易的摇摆式离心机去除气泡。再加入上层，进而两层之间形成一个明显的界面，它们会逐渐彼此扩散。 Garc´?a-Ruiz and Moreno（1994）已经发展液-液扩散技术至针刺法。蛋白质溶液通过毛细力被吸入狭窄的管中，管的一端是封闭的。接着，开放端被插入置于小容器的凝胶中，凝胶使得管竖直，蛋白质溶液与凝胶接触。含有沉淀剂的溶液被倒在凝胶上，整个装置被保存于封闭的盒子以防蒸发。沉淀剂通过凝胶和毛细管的扩散时间可以由毛细管插入凝胶的深度控制，从而蛋白质溶液中即可形成过饱和区域，毛细管底部高而顶部低。这也可作为一个筛选最佳结晶条件的额外信息。
1.1.3 蒸气扩散（Vapor Diffusion）
1.1.3.1 悬滴法（The Hanging Drop Method）这种方法中，在一个硅化的显微镜盖玻片上通过混合3-10μl蛋白质溶液和等量的沉淀剂溶液来制备液滴。盖玻片置于一个盘子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀剂溶液约1ml。在盖玻片放好之前，小室的凹槽周围用油或油脂密封（如图3）。
1.1.3.2 沉滴法（The Sitting Drop Method）在悬滴法中，如果蛋白质溶液表面张力很小就会在盖玻片表面展开。此时，沉滴法更有利，图4给出了沉滴法的简图。
1.1.4 透析法（Dialysis） 除了上述使得蛋白质结晶的方法，还有许多透析技术。透析的优点是沉淀溶液容易改变，对于适量的蛋白质溶液（多于0.1ml），可用透析管完成（如图1.5a）。透析膜通过橡皮圈连在管子上，但在使用前要用水大量漂洗或最好在水中煮约10min。对微升量的蛋白质溶液而言，可以使用覆有透析膜的厚壁微毛细管（Zeppezauer method）或者树脂玻璃纽扣（如图1.5b）。纽扣的缺点是纽扣中的蛋白质晶体不能通过极化显微镜观察到。
另一中微透析方法在图1.6中有描述，将5μl蛋白质溶液注射到一个毛细管中，毛细管覆有透析膜，膜可用塑料管套紧。对蛋白质溶液进行简单离心，然后用铸模粘土将毛细管封闭，接着将毛细管放入含有透析液的Eppendorf管中。